Hibridación fluorescente in situ

La hibridación fluorescente in situ (FISH) es una técnica citogenética que se puede utilizar para detectar y localizar la presencia o ausencia de secuencias específicas de ADN en los cromosomas. Utiliza sondas de fluorescencia que se unen de forma extremadamente selectiva debido a una secuencia complementaria a ciertas regiones específicas del cromosoma. Las técnicas de microscopía de fluorescencia se utilizan para identificar el vínculo entre la sonda y el cromosoma. Fue desarrollado por investigadores biomédicos a principios de los 80. FISH también se puede utilizar para detectar y localizar dianas específicas de ARN (ARNm, arnin y miRNA) en células, células cancerosas circulantes y muestras de tejido. En este contexto, puede ayudar a definir patrones espacio-temporales de expresión génica dentro de las células y tejidos.

Para preparar la sonda, que debe ser lo suficientemente largo como para hibridar exactamente su objetivo (y no otra secuencia similar del genoma), pero no debe ser tan grande como para impedir el proceso, y puede ser marcado con métodos directos o métodos indirectos se prefieren, métodos indirectos en los que la señal se determina, no directamente de un fluorocromo unido a un nucleótido de la sonda, sino por la interacción de biotina o digoxigenina unido a un nucleótido siempre de la sonda, con sustratos (anticuerpos avidina / estreptavidina o anti-digoxigenina) unidos directamente a un fluorocromo Las sondas de ARN se pueden diseñar para cualquier gen o cualquier secuencia dentro de un gen para mostrar mRNA, lncRNA y miARN en tejidos y células. FISH se utiliza examinando el ciclo de reproducción celular, particularmente durante la interfase del núcleo para resaltar cualquier anomalía cromosómica. Este método permitirá la visualización de una señal mejor y más intensa, en comparación con una marca directa del nucleótido de la sonda. Se puede hacer de varias maneras, por ejemplo con la traducción de nick y la reacción en cadena de la polimerasa usando nucleótidos Etiquetados. Luego, se produce una preparación cromosómica. Los cromosomas están firmemente unidos al sustrato, generalmente de vidrio. Después de la preparación, la sonda se aplica al ADN del cromosoma y comienza la hibridación. En muchos pasos de lavado se eliminan todas las sondas no hibridadas o parcialmente hibridadas. Las sondas a menudo se derivan de fragmentos de ADN que han sido aislados, purificados y amplificados para su uso en el proyecto del Genoma Humano. El tamaño del genoma humano es tan grande, en relación con la longitud que podría ser secuenciado directamente, que fue necesario dividir el genoma en fragmentos. (En el análisis eventual, estos fragmentos fueron puestos en orden digiriendo una copia de cada fragmento en fragmentos aún más pequeños usando endonucleasa específica de la secuencia, midiendo el tamaño de cada fragmento pequeño usando el tamaño de la cromatografía de exclusión y usando esa información para determinar dónde los fragmentos grandes se superponían entre sí). Para preservar los fragmentos con sus secuencias de ADN individuales, los fragmentos se agregaron en una población de bacterias que se replicaban continuamente. Cada población que mantiene un solo cromosoma artificial, se almacena en varios laboratorios de todo el mundo. Los cromosomas artificiales (BACS) se pueden cultivar, extraer y etiquetar en cualquier laboratorio que contenga una biblioteca. Las bibliotecas genómicas a menudo reciben el nombre de la institución en la que se desarrollaron. Un ejemplo es la biblioteca RPCI-11, que lleva el nombre del Roswell Park Cancer Institute en Buffalo NY. Estos fragmentos son del orden de 100 mil pares de bases y forman la base para la mayoría de las sondas de peces. Si se requiere amplificación de la señal para exceder el límite de sensibilidad del microscopio (que depende de muchos factores como la eficiencia de la sonda, el tipo de sonda y el tinte fluorescente), los anticuerpos fluorescentes o la estreptavidina se unen a las moléculas etiquetadas, para amplificar su fluorescencia. Finalmente, la muestra se coloca en un compuesto no blanqueador y se observa bajo un microscopio de fluorescencia. En la interfase de peces, la sonda se aplica a preparaciones con núcleos, incluidas citospinas, secciones parafínicas o incluso núcleos extraídos de bloques parafínicos. La hibridación se lleva a cabo de manera similar. Las señales fluorescentes se ven como puntos en el núcleo celular, que generalmente se colorea con un tinte de contraste que reconoce el ADN. En Fiber-FISH, los cromosomas interfásicos se hacen para adherirse a una diapositiva de modo que se alargan y se estiran en forma de una fibra de cromatina de bobinado mínimo, en lugar de en una conformación relativa a los territorios nucleares visibles en un pez interfásico normal. Los portaobjetos se exponen a una solución de ADN purificada o se siembran con células tratadas con soluciones de proteinasa y lisis. La distensión de los cromosomas permite una resolución mucho mayor del pez, hasta 1 kb. La preparación de muestras de fibra de pescado, aunque conceptualmente simple, es en realidad bastante compleja en su ejecución y es realizada por unos pocos laboratorios especializados.

FISH se puede utilizar para mapear las secuencias de un cromosoma específico. Aunque hay otras formas de hacerlo, la principal ventaja de FISH es que no depende de la recombinación y por lo tanto puede ser utilizado en regiones cromosómicas donde se suprime, como en el centrómero. Se puede usar para mapear las secuencias repetitivas que ocurren en diferentes puntos del cromosoma. FISH también se puede utilizar para colorear cromosomas para comparar dos especies o variedades utilizando el ADN de cromosomas enteros o incluso el genoma completo de una especie o variedad como una sonda en el estudio de Otra especie o variedad. De esta manera, se pueden identificar anomalías cromosómicas y se pueden inferir relaciones evolutivas. Los peces se pueden utilizar para identificar microorganismos y se utilizan ampliamente en el campo de la microecología. Las biopelículas son (a menudo), por ejemplo, complejas organizaciones bacterianas multiespecies. La preparación de las sondas para una especie y el uso de los peces con esta sonda le permite visualizar la distribución de esta especie específica en el biofilm. Preparar la sonda (en dos colores diferentes) para dos especies permite observar y estudiar la colocación de estas dos especies dentro del biofilm, revelando la arquitectura final del biofilm. FISH también se aplica en ensayos clínicos para averiguar si un paciente ha sido infectado con un patógeno, bacterias tomadas de los tejidos o fluidos del paciente generalmente se desarrollan en agar agar (un polisacárido) para determinar la identidad del patógeno. Sin embargo, muchas bacterias, incluso las que se conocen desde hace mucho tiempo, no crecen muy bien en el laboratorio. El FISH se puede utilizar para definir directamente la presencia del patógeno en las muestras de tejido del paciente. Las sondas bacterianas de peces son a menudo inyectores para la región 16S rRNA.

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